A pesar de que la mayor parte del tiempo durante los juegos de Assassin’s Creed lo hemos pasado controlando a Altaïr o Ezio, el verdadero protagonista de la saga es un joven americano de nuestra era, Desmond Miles. Nació en un complejo en Dakota del Sur llamado “La Granja”, habitado por un pequeño grupo de Asesinos. Durante años recibió una educación de manera estricta por parte de sus padres sobre los preceptos de La Hermandad, y eso sumado a la vida confinada en el complejo provocaron en Desmond la sensación de vivir en una cárcel, por lo que la noche que cumplió 16 años escapó.
Durante años deambuló por todo el país sirviéndose de sus habilidades como asesino para permanecer oculto a los Templarios y Asesinos por igual, pero en diciembre de 2012 gracias a una huella dactilar, los templarios dieron con él en Italia y lo apresaron. Bajo las órdenes de Warren Vidic fue introducido en el Ánimus, una máquina que permitía al usuario revivir los recuerdos de sus antepasados, con la intención de descubrir la ubicación de algo llamado Fragmentos del Edén, que se creía en posesión de Altaïr Ibn-La’Ahad, un Asesino sirio que vivió en el siglo 12. Durante varios días Desmond permaneció atrapado en unas instalaciones de los Templarios, permitiéndole descansar tan solo brevemente tras intensas sesiones dentro del Ánimus, algo que la ayudante de Vidic, Lucy Stillman, desaconsejaba pues podía producir demencia, quebrando la mente de Desmond siendo este incapaz de diferenciar la realidad de los recuerdos.
Finalmente resultó que Lucy era una Asesina, y durante las noches permitió a Desmond deambular libre, además de informar a los asesinos de su estado y ubicación. Estos intentaron rescatarlos pero los Templarios acabaron con todos, por lo que las esperanzas de Desmond se desvanecieron. Finalmente los Templarios alcanzaron su objetivo consiguiendo la ubicación de varios Fragmentos, por lo que abandonaron el edificio dejando a Desmond encerrado para matarlo a su vuelta. Fue en ese momento cuando Lucy aprovechó para sacarlo del edificio y llevarlo a un piso franco de los Asesinos, con el plan de revivir los recuerdos de otro antepasado suyo, Ezio Auditore, para encontrar otro Fragmento del Edén y así poder combatir a los templarios, además de entrenar a Desmond mediante el Efecto Sangrado. Sin embargo, tal y como Lucy le avisó, las numerosas horas dentro de la máquina estaban empezando a pasar factura a su salud.
El piso franco fue atacado por los templarios, dirigidos por Warren Vidic, por lo que tuvieron que interrumpir su entrenamiento y huir a Monteriggioni. Una vez escondidos, de nuevo Desmond siguió reviviendo los recuerdos de Ezio, llevándole a la ubicación de un Fragmento en Roma, concretamente bajo la basílica de Santa María de Araceli. Una vez dentro y en contacto con el Fragmento, este tomó el control del cuerpo de Desmond, obligándole a matar a su amiga Lucy.
El shock de matar a su amiga, sumado al daño que el Ánimus había provocado en su mente, provocó que entrara en coma. Fue rescatado por un grupo de asesinos dirigidos por alguien llamado William M., el cual ordenó meter de nuevo a Desmond en el Ánimus con la intención de mantenerlo con vida. Despertó en una región dentro del Ánimus conocida como La Sala Negra, donde esperaba recomponer su mente y sus recuerdos. Poco a poco empezó a recordar su infancia y su educación como asesino, mientras terminaba de revivir los recuerdos de Altaïr y Ezio, consiguiendo con ello comprender quién era y su cometido, y despertando al fin para encontrarse de nuevo frente a su padre, William Miles.
Además de sus habilidades proporcionadas por su entrenamiento en La Granja cuando era pequeño y las incontables horas que pasó dentro del Ánimus, su ADN posee una gran cantidad de genes de La Primera Civilización, permitiéndole controlar Fragmentos del Edén. En la versión original se encarga de su voz el conocido actor de doblaje Nolan North, mientras que en nuestro país esa tarea recae sobre Guillermo Romero. Como curiosidad, su aspecto ha sido rediseñado en cada entrega de la saga para que se pareciera más a sus antepasados, por lo que durante el primer juego su rostro es parecido al de Altaïr, durante la segunda entrega a la de Ezio y de nuevo durante los eventos de Assassin’s Creed 3 para parecerse a Connor.
